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2007-1 생명공학기초(1)
제6장
Enzyme
Department of Biotechnology,
Daegu University
Copyright 2005-2007 by Prof. Jong Won Yun
Why enzyme in biotechnology ?
Cells
Well Being
세포배양
제품생산
효소생산
효소분리
효소생산
효소반응
1. 효소의 역사 / History of enzyme
효소의 발견 및 발전역사 개요
o BC: 약 7000년 동안 동물의 위에서 chymosin을 이용, 치즈를 만들어 먹었음.
o 1850s, Louis Pasteur :
fermentation of sugar into alcohol by yeast is catalyzed by "ferments".
........inseparable from living cells.
o 1878, Kuhne : first used term "enzyme"(Greek "in yeast")
o 1894, Emil Fischer : enzyme specificity('lock and key' hypothesis)
o 1897, Eduard Buchner :
succeeded in extracting in soluble enzyme(sugar→alcohol)
o 1926, James Sumner :
isolation of enzyme(urease) in crystalline form. "enzyme consists of protein"
o 1930s, John Northrop :
crystallized pepsin and trypsin. found them proteins → widly accepted
1958 : Koshland에 의해 Induced fit model 발표
1. 효소의 역사 / History of enzyme (계속)
o 1960 : amino acid sequence of ribonuclease
o 1965 : three-dimensional structure of lysozyme (by X-ray crystallography)
allosteric model 발표
o 1969 : 화학합성법에 의한 효소합성기술 보고
o 1980's - present : protein engineering (enzyme design, directed evolution 기술개발)
분자생물학 기술이 접목되어, 효소생산성을 크게 증가.
o 1990's - present : proteomics (proteome analysis) : 생명체 내의 전체 단백질(효소) 연구
o 2004 : Computer designed enzyme 보고
21세기: 식품보다 의약품 설계 및 생산에 관심이 크게 증가.
효소의 정의 (Definition)
• What is Enzyme ?
biological catalyst. highly specialized proteins with catalytic activity catalyst:
speed up the rates of reactions without themselves undergoing any permanent
change. (자기 자신은 변하지 않고 반응속도만 증가)
• Activation energy of enzyme: the amount of energy in calories required to bring
all the molecules in 1 mol of a substrate at a given temperature to the
transition state at the top of the energy of the barrier.
효소의 분류 (Nomenclature and Classification )
o the suffix "-ase" is added either to the substrate name or reaction.
(ex) urease.....urea decomposition into CO2 and ammonia
alcohol dehydrogenase......oxidative dehydrogenation reaction of alcohol
효소의 분류 (Enzyme Commission Classification System)
효소를 분류해야 하는 너무나 당연한 이유 ?
• 동일한 기능을 수행하는 효소를 두고 서로 다른 명칭이 붙는다면 ?
• 한국에서 덴마크 Novo 사에 효소를 구매할 경우 효소의 이름만으로
구매 신청을 하게 되면 유사한 기능을 수행하는 원하지 않는 효소를 입수
할 가능성이 있다.
• 원하는 효소의 기능이 정해지면 정확한 분류번호가 있을 경우, 효소를
구매할 때 효소의 이름과 분류번호를 동시에 말해주면 원하는 효소를 구입
할 수 있다.
효소의 분류 (Enzyme Classification)
http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html (반드시 방문해 보기)
1) 산화환원계 효소 / Oxidoreductase (oxidation-reduction reactions)
: Transfer of H, O atoms or electrons
transfer of H to O2: oxidase/ to other than O2: dehydrogenase
1.1. acting on -CH-OH (alcohol)
1.2. acting on -C=O (aldehyde or ketone)
1.3. acting on -CH=CH1.4. acting on -CH-NH2 (primary amine)
1.5. acting on -CH-NH- (secondary amine)
1.6. acting on NAD(P)H
2) 전이효소 / Transferase (transfer of functional groups: AX+B=BX+A)
donor: acceptor transferase
X-transferase or trans-X-ase (ex) fructosyltransferase = transfructosylase
2.1. one-carbon groups
2.2. aldehydic or ketonic groups
2.3. acyl groups
2.4. glycosyl groups
2.7. phosphate groups : phosphotransferase = "-kinase"
2.8. S-containing groups
3) 가수분해효소/ Hydrolase (hydrolysis reactions)
3.1. esters (esterase)
3.2. glycosidic bonds (glucosidase)
3.4. peptide bonds (peptidase)
3.5. other C-N bonds
3.6. Acid anhydrides
4) 용해효소 / Lyases
: Non-hydrolytic removal of groups from substrate, often leaving double bonds or
adding groups to double bonds)
4.1. -C-C- (bond broken)
4.2. -C-O
"
4.3. -C-N
"
4.4. -C-S
"
5) 이성화효소 / Isomerase (isomerization reactions)
5.1. Racemization or epimerization(racemase, epimerase)
5.2. Cis-trans isomerase
5.3. intramolecular oxidoreductase
5.4. intramolecular transfer reaction
6) 결합효소 / Ligase (formation of new bonds with ATP cleavage)
X+Y+ATP = X-Y+ADP+Pi
6.1. C-O, 6.2. C-S, 6.3. C-N, 6.4. C-C
Enzyme Commission (EC) Number – Example
ATP:glucose phosphotransferase → EC 2.7.1.1
where, 2: class name(transferase)
7: subclass(phosphotransferase)
1: sub-subclass(phosphotransferase with a hydroxyl group
as acceptor)
1: for D-glucose as the phosphate-group acceptor
Systematic name and Trivial name for enzymes
(ex) ATP:glucose phosphotransferase → kexokinase
(systematic)
(trivial)
학술적으로 사용하는 이름
현장에서 사용하는 이름
Amino acid, a building block of protein
효소의 기본단위 “아미노산”을 잘 알자
C-terminus
N-terminus
아미노산 번호 붙이는 순서
N
Amino acid, a building block of protein
Nonpolar (hydrophobic)
Amino acid, a building block of protein
Ionizable, acidic
Nonionizable, polar
Polar (hydrophilic)
Amino acid, a building block of protein
Ionizable, basic
Polar (hydrophilic)
Amino acid, a building block of protein
Nonpolar (hydrophobic)
Nonionizable, polar
Amino acid, a building block of protein
Nonpolar
Nonionizable,
Nonpolar
polar
Nonpolar
Nonpolar
Enzyme structure & functions
Protein = (peptide)m+ (disulfide)n
Peptide bond formation
Resonance
Peptide bond
Disulfide bond (-S-S-) formation
효소의 구조 (Enzyme Structure)
1차 구조의 중요성 (amino acid sequence)
Water & H-bond
Hydrogen bonds
Bonds in Protein
2차구조 (Secondary structures)
(Pleated) -sheet
-helix
대부분의 단백질들은 α-helix, β-sheet 모두로 구성되어 있고, 이들 중 어느 하나로만
구성되어 있는 단백질은 길고 가는 형태의 섬유상 단백질 (fibrous protein)이다. 짤막
짤막한 α-helix, β-sheet 구조가 함께 조밀하게 존재할 때는 단백질의 형태는 보통
구형단백질 (globular protein)이다.
3차 구조 (Tertiary structures)
All -helix
All -sheet
-helix + -sheet
4차 구조 (Quertary structures)
Assemblies of tertiary structural units
단백질 접힘 (folding)
Polypeptide chain은 합성 후 곧 접혀진다. 이러한 접히는 과정을 folding이라고 하며, 대부분의 경우에 화
학적 변형(chemical modification)이 일어나 단백질을 생성해낸다. 이론적으로 어떤 폴리펩타이드가 n개의
가지 사슬(residue)을 가지고 있다고 하면, 8n개 만큼 변형된 형태가 생겨날 수 있다. 하지만 일반적으로 어
떤 종류의 단백질이든 모든 분자들은 하나의 형태만 허용한다. 이를 정상상태(native state)라고 하며, 분
자가 가장 안정된 형태로 접혀져 있는 상태를 말한다. 잘못 접혀져서(misfolding) 비정상적(non-native) 형
태가 되는 것을 막는 기전에는 두 가지가 있다. 분자 수준에서 보면 단백질은 중간단계가 몇 개 없는 경로
를 선호하여 이 경로로 folding을 한다. 더 나아가서 세포 수준에서 보면 단백질의 생존 기간에 제한을 주
는 특별한 서열이 잘못 접혀진 단백질을 표적으로 삼아서 활성을 감소시키게 한다.
Protein folding은 아미노산 서열에 의해 결정
단백질의 아미노산 서열이 folding에 영향을 미친다는 사실을 시험관 내에서(in vitro) 실험을 하여
알아내었다. 열에너지나 pH에 의해 아미노산 가지사슬의 전하가 변할 수도 있고, urea나 6-8 M의
guanidine hydrochloride과 같은 화학약품에 의해 비공유결합이 깨져서 단백질이 비정상적 형태로 바뀔
수도 있다. 이와 같이 단백질이 형태가 변형되고 활성을 잃게 되는 것을 변성(denaturation)이라
한다. 대부분의 변성된 단백질은 용액 내에서 침강하게 되는데, 이는 평상시에는 분자의 안쪽에
존재하던 소수성기들이 접힘이 풀리면서(unfolding) 서로 엉겨 붙게 되어 물에 녹지 않고 가라앉기
때문이다.
효소의 변성과 활성회복
denaturation and renaturation
of proteins
8M 농도의 요소나 β-mercaptoethanol과 같은 화
학약품들은 황결합(disulfide bond, -S-S-)을 환
원시켜 주어 단백질의 접힘을 완전히 펴주는
역할을 한다. 그러나 투석(dialysis)에 의해 이
와 같은 화학물질들을 제거하면 다시 원래대로
단백질이 접히게 된다(refold). 이를 탈변성
(renaturation)이라고 하며, 탈변성이 일어나는
동안 모든 황, 수소, 소수성 결합들이 정상적 형
태로 돌아와 안정하게 된다. 그러므로 이러한
경우의 단백질들은 변성과 탈변성의 주기를 통
해 파괴되었던 단백질이 다시 원래의 구조와
기능을 회복하게 된다는 것을 알 수 있다. 그리
고 적어도 시험관 내에서는 탈변성 과정 중에
보조인자나 다른 단백질이 필요하지 않기 때문
에 단백질의 접힘(folding)이 자가조립과정이라
는 것을 알 수 있다.
Post-translational regulation (modification) of proteins
Post-translational modification of a protein can have a profound effect on its structure, and
consequently affect its activity or function. Phosphorylation (the covalent attachment of a phosphate
group to either serine, threonine or tyrosine) is the most common modification, and is catalyzed by
enzymes known as protein kinases. The human genome is thought to encode thousands of different
protein kinases, which function to regulate virtually all aspects of a cells behavior, including chromatin
structure (histone phosphorylation), gene expression (transcription factor activity), cell proliferation
(growth factor receptors, cyclin dependent kinases, MAP kinases), metabolic activities, etc.
The additional negative charge of a phosphate group (or groups) alters the balance of non-covalent
interactions which determine secondary, tertiary or even quaternary structure. The resulting change in
conformation of the protein may cause (i) activation or inactivation of a biological function, or (ii)
association or dissociation of sub-units. In the example below, phosphorylation of a serine residue in an
inactive enzyme molecule results in a conformational change which exposes the catalytic site and
activates the enzyme.
Functions of proteins
Catalysts (enzymes) : 3-D stereospecific chemical catalysts
accelerate desired reactions by as much as 10 10 times over their
spontaneous rates.
Rigid structure : collagen in connective tissue, bone; keratin in
fingernails and hair; silk fibers
Transport : membrane transport proteins carry substances across cell
membranes; blood transport proteins that move certain substances
(e.g., iron, oxygen, cholesterol) throughout the body.
Hormones : chemical signals. Some hormones consist of as little as a
single amino acid. Others are peptides or polypeptides. (Ex) insulin
Contraction : muscle fibers, cilia, spindle fibers in mitosis. (Ex) actinmyosin interaction to produce muscle contraction
Specific binding : (Ex) antibodies that bind specifically to foreign
substances to identify them to the body's immune system
Hormone
The metabolic effects of insulin
Small particles are glucose
Glucose transporters (GLUT)
Contraction
muscle fibers, cilia, spindle fibers in mitosis
muscle contraction
Advantages and Disadvantages in Enzyme industry
Advantages:
1) substrate selectivity (specificity)
2) mild reaction conditions (temp, pressure, media, etc.)
3) high reaction yield, fast reaction rates
Disadvantages:
1) use of low substrate concentration
2) low thermal stability, low long-term stability
3) formation of by-products → additional separation
process
Advantages and Disadvantages in Enzyme industry
Example - Ethanol production processes
Chemical process : hydration reaction of ethene and water
(use) chemical
Biochemical process : fermentation from starch using either
baker's yeast (S. cerevisiae)
or bacteria Zymomonas mobilis
(use) liquor
왜 미생물효소인가 ? (Why Microbial Enzymes?)
생물공학 제품 생산공정에서 생촉매 (biocatalysts)로 사용될 수 있는 효소의 기원은 미생물,
동물세포, 식물세포 등이 있으나 그중 미생물효소가 가장 광범위하게 사용된다. 그 이유는 1)
생산시간이 짧다. 식물세포처럼 계절의 영향을 받지 않고 동물세포처럼 배양이 어렵지 얺기
때문이다. 대장균이 20분만에 딸세포를 만드는 것을 상상해 보라.
미생물효소를 생산하여 사용할 때 다음과 같은 점들이 중요하다.
① 현재 미생물이 원하는 효소를 최고농도로 생산하는가? 아니면 보다 우수한 미생물을
탐색할 필요가 있는 것인가? 또는 변이주를 만들어 이용할 필요가 있는가?
② 최적의 발효조건에서 효소를 생산하고 있는가?
③ 효소의 회수방법은 최선인가?
④ 효소가 미생물세포 어느 부분에 존재하는가?
⑤ 효소를 고정화하여 이용할 필요가 있는가?
⑦ 효소를 정제하여야 하는가 아니면 crude 상태로 사용가능한가?
위의 ④, ⑤항은 원심분획 (centrifugal fractionation)방법에 의해 효소의 존재위치를 파악할 수
있고 고정화 필요성 여부를 판단할 수 있다. 대부분의 효소가 미생물의 cytosol 보다
periplasmic space 에 존재한다면 고정화가 유리하다. 왜냐하면 기질 및 생성물의 물질전달이
용이하기 때문이다.
Enzyme Reaction Models
1. Lock and Key Model
Enzyme Reaction Models
2. Induced Fit Model
Enzyme-Substrate Reaction
Active site
(ex. Ribonuclease)
What happens in active site ?
(ex) chymotrypsin
For serine protease, http://info.bio.cmu.edu/courses/03231/Protease/SerPro.htm
Why immobilized enzyme ?
How to stabilize enzyme?
• Addition of substrate analogues
• Addition of sugar alcohols (e.g. sorbitol)
• Addition of cofactors (e.g. calcium ion)
• Immobilization : reuse & long-term stability !
Immobilization of Enzyme?
Brief History
1961, invertase → charcoal adsorption
.........
1969, immobilized aminoacylase → DL-amino acids production
1971, Definition (1st Enzyme Engineering Conference)
"enzymes physically confined or localized in a certain defined
region of space with retention of their catalytic activities, and
which can be used repeatedly and continuously".
Advantageous conditions and factors
1) No purification of enzyme after production
2) High enzyme activity (high reactor activity)
3) Enhanced operational stability
4) Low enzyme cost
5) Application of multienzyme reaction is possible
Enzyme Immobilization
Immobilization by Entrapment
주요 재료:
Alginate ..... CaCl2 (가장 일반적인 방법)
κ-carrageenan....AlCl3 / polyacrylamide / agar 등을 사용.
Advantages: o long-term stability (장기 안정성)
o Easy preparation (제조하기 쉬움)
Disadvantsges: o poor mechanical stability (강도가 약함)
o compression and shear damage (약함)
o transport limitation (물질전달 불리)
Immobilization by Binding
Adsorption: Electrostatic interactions(van der Waals forces, ionic
and hydrogen bonds betweeen the cell surface and the support
materials
cell wall composition: determined by distribution of carboxyl and
amino groups of the peptide amino acids of cell wall surface
(ex) yeast cells are negative charge, thus choose a positively charged
support
Advantages: ability to regenerate the support
Disadvantsges: low stability (desorption of cells due to changes of
pH and/or ionic strength)
Covalent-binding methods
Advantages: o free of diffusional limitations
o high operational stability
o uniform binding
Disadvantages: o toxicity of the coupling agents(loss of activity and cell
viability, not acceptable in food and pharmaceutical fields)
o hard to regenerate the supports
Methods for Covalent Binding of Enzyme
Diazotization :
--N=N--E
Amide bond formation :
--CO-NH--E
Alkylation and Arylation:
--CH2-NH-E
--CH2-S--E
Schiff's base formation :
--CH=N--E
Amidation reaction :
--CNH-NH--E
Thiol-Disulfide interchange: --S-S--E
Carrier binding with bifunctional reagents :
-O(CH2)2 N=CH(CH2)3 CH=N-E
Support for enzyme binding E: Enzyme
효소를 지지체 (support material)에 강력하게 고정화 시키기 위해서는 먼저 지지체를 화학처리하여 효소가
공유결합을 형성할 수 있도록 하여야 한다. 여러 가지 화학물질이 이 목적으로 사용되는데, Bromine cyanide,
azide, carbodiamide, diazo 시약을 사용하는 방법이 효과적인 것으로 알려져 있다. 단점은 이들 시약들이 식
품공업에서는 독성을 나타낼 수 있다는 점이다.
Carrier-free immobilization
1)
Flocculation or pelletization of cells in the course of their fermentation or
by secondary processes under appropriate parameter variations
(e.g., ionic strength, pH, temp.)
2) or use of flocculating agents
o cationic polyelectrolytes.......polyamines
o cationic polyacrylamides
o anionic polyelectrolytes.......polystyrene sulfonate, polycarboxyl acids
o metallic compounds....... hydroxides, sulfate, phosphates of Mg2+, Ca2+
3) direct chemical cross-linking of cells with bivalent coupling reagents
(e.g., glutaraldehyde)
Advantages:
very high cell(enzyme) density
operation under physiologically mild conditions
Disadvantages: poor mechanical stability
compression and shear damage
transport limitation
Immobilized Enzyme Reactors- example 1
(Batch)
CSTR
PBR
Membrane Bioreactor
FBR