Transcript Vibrio harveyi

海洋微生物與生物技術—
基因改造
黃顯宗
遺傳工程的應用
• Marine biotechnology
• Use of microorganisms to produce
proteins
• Environmental biotechnology
Marine biotechnology
• fish farming (aquaculture)
• seaweed farming to produce fatty acids, etc.
• production of adhesives from mussels and
barnacles
– https://en.wikipedia.org/wiki/Barnacle#/media/File:C
hthamalus_stellatus.jpg
• use of enzymes from thermophile bacteria
(usually living in dark, sulphurous, hot
environments in the deep sea) for waste
removal, or in sequencing DNA
Use of microorganisms to produce proteins
• use of bacteria and yeasts to ferment
petrol derivatives, whey, wood cellulose,
etc.
Environmental biotechnology
• pollution fighting using enzymes or
microbes (eg. oil spills)
• use of plants（algae）to remove
contamination by heavy metals
• water treatment
• treatment of air pollution
GMO定義
• 聯合國糧農組織/世界衛生組織
（FAO/WHO）所組成之食品標準委員會
（Codex）及歐聯法規對GMO之定義基
因遺傳物質被改變的生物，其基因改變的
方式係透過基因技術，而不是以自然增殖
及/或自然重組的方式產生。
基本遺傳工程技術
• 目標基因
• 標示基因（如抗藥性基因） ？
• 遺傳工程技術
GMO的製作
• 載體（vector）
動植物基因轉殖技術
• 轉形之定義
• 動植物轉形之方法
– 電擊
– 顯微注射法（micro-injection）
– 巨量注射法（macro-injection）
– 微膠囊法（micro-encapsulation）
– Agrobacterium tumefaciens-經手
應用metagenomics和bioinformatics的發展
• Metagenomics是新的研究領域，可澄清
不能培養微生物的基因組，增加認識全球
微生物生態，同時也是新酵素和新生物份
子（biomolecule）的來源
• 海洋中少於1％微生物可被培養，所以不
能以培養為先
應用metagenomics和bioinformatics的發展
• 從各種已經基因的consensus sequences 設計
PCR，從海洋分離或未分離的微生物核酸中，
增幅出特定基因的序列，進行cloning，或許難
得到全新（novel）的酵素基因
• 或使用 features characteristic of particular
enzyme genes，進行增幅得特色的基因片段，
獲得新的基因，如esterases, lipases, chitinses,
amidases, celluloses, alkane hydrolases,
proteases等
Metagenome technologies
• DNA extraction, library construction, screening
• 核酸盡可能粹取自廣大的微生物群，才能代表
original microbial population
• 過程中盡量避免shearing of DNA，因為常需要
較大的核酸分子，
• 小核酸片段可能會造成選出不完整的chimeric
products（嵌合體）.
• 核酸必須無其他物質的污染，影響DNA
processing，such as restriction， ligation等
Metagenome technologies
• Cloning strategies
•
• Screening technologies
– 選殖（cloning）後，表現出功能蛋白，從功
能篩選clones（function based）
– 或使用序列篩選（sequence-based
screenings）
高壓（piezophilic）細菌的遺傳系統
• psychro-piezophiles such as Photobacterium
profundum SS9，Shewanella piezotolerans
WP3
• 發展出entire set of conjugal vectors for cloning,
expression and insertional mutagenesis
• 最被認識的系統是Archaea Pyrococcus abyssi
GE5, P. yayanosii 和 Thermococcus
barophilus MP等
高壓（piezophilic）細菌的遺傳系統
• 深海細菌是新的研究資源，透過培養和非
培養的方法，研究生物活性物質
• 如actinomycete的二級代謝物
• 其他如omega-3- polyunsaturated fatty
acids (PUFAs) 的生產，特別是
eicosapentaenoic acid (EPA)和
docosahexaenoic acid (DHA)等
藻類Algae方面
• 基改藻類（algal transgenics）作為
bioreactors
• 現代非基改的藻類生技產品，都可以透過
基改改進應用，可稱為molecular farming
• food additives, cosmetics, animal feed
additives, pigments, polysaccharides,
fatty acids, biomass等
藻類Algae方面
• 已經發展Selectable marker genes,
promoters, reporter genes,
transformation techniques和其他遺傳工
具（genetic tools）和方法
• 應用在約25 species藻類的基因轉形
（genetic transformation）
藻類Algae方面
•
•
•
•
大規模定序進行中，部分完成
red alga Cyanidioschyzon merolae
diatom Thalassiosira pseudonana,
green algae Chlamydomonas reinhardtii,
Volvox carteri and Ostreococcus tauri.
藻類Algae方面
• http://www.unibielefeld.de/biologie/Zellbiologie/publik/paper/2007tpj.
pdf
藻類Algae方面
• http://www.unibielefeld.de/biologie/Zellbiologie/publik/paper/2007tpj.
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藻類Algae方面
• http://www.unibielefeld.de/biologie/Zellbiologie/publik/paper/2007tpj.
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藻類Algae方面
• http://www.unibielefeld.de/biologie/Zellbiologie/publik/paper/2007tpj.
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• 藻類研究中有數個轉形方法，最常用的是microparticle bombardment，或稱為 micro-projectile
bombardment, particle gun transformation,
gene gun transformation, 或直接稱為biolistics
• 該方法是將DNA-coated heavy-metal (mostly
gold) 投射入細胞，不受細胞壁厚薄影響
藻類Algae轉形
• http://www.unibielefeld.de/biologie/Zellbiologie/publik/paper/2007tpj.
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生物Fuel
• 克服石化燃料（fossil fuel）的匱乏，全球暖化
（global warming）等議題，促進替代能源的研
究
• 大海帶（giant kelp Macrocystis pyrifera ）和其
他藻類被研究
• 作為生質（biomass）無氧發酵（anaerobic
fermentation）轉換至methane
• Methane可用作燃料（fuel）
• 尚須要大規模研究
水土復育
Bioremediation of water and soil
• 水土常受重金屬污染
• Lead, cadmium, mercury最常見
• 工業成造成污染源。如塑膠、電鍍
（electroplating）、Ni-Cd 電池、採礦等
• 可應用微生物作為bioremediation
• 藻類會攝取（take up）重金屬，如cadmium
• 重金屬會誘發heavy metal stress response
水土復育
Bioremediation of water and soil
• 特別產生能夠吸附重金屬的因子、蛋白質
• 當然高量的重金屬會影響到藻類的光合作用和
生長等，甚至殺死藻類
• 野生的綠藻Chlamydomonas reinhardtii在生長
期可以忍耐相當濃度的Cd
• 經過基因改造，能表現mothbean （蛾豆）
P5CS gene，可以生長在更高濃度的Cd中
• P5CS蛋白質參與proline的合成，和細胞的
osmoregulation有關
分子農場Molecular farming
• 在microalgae的研究中，Molecular farming，
或稱為molecular pharming，biopharming或
gene pharming
• use of genetically altered organisms for the
production of therapeutics
• 生成有用生物分子（biomolecules），用於醫
藥或工業
• 在別處可能困難或無法生成，或者極耗費資源
• 例如，借用algal systems大量生產抗生素
• 在Chlamydomonas reinhardtii合成recombinant
human monoclonal IgA Antibody
製作基因改造Vibrio harveyi，監測環
境致突變毒素
• 現在使用Salmonella的Ames test來檢測致突變
性毒素，
• 不過，不適合使用在海洋的環境中
• 選擇海洋細菌作為監測
• Vibrio harveyi 是游離生長（free living）的細菌，
存在於多樣化的海洋環境中
• 在該菌加入抗藥性和mucA、mucB 等基因，這
些基因負責增加error-prone DNA repair system
調控
• 改造後，對於致突變性毒素，比野生株更敏感
製作基因改造Vibrio harveyi，監測環
境致突變毒素
• Vibrio harveyi
• BB7 Wild type 3
• BB7X As BB7, but bearing Tn5Tp inserted into the
chromosome; UV sensitive
• BB7M As BB7, but bearing plasmid pAB91273
• BB7XM As BB7X, but bearing plasmid pAB91273
• pAB91273 containing the the mucA and mucB genes
製作基因改造Vibrio harveyi，監測環
境致突變毒素
重組DNA技術用在生產疫苗，針對病毒與
細菌所造成的疾病
• 病毒只活在活細胞中，一些病原菌
Renibacterium salmoninarum和Piscirickettsia
salmonis也難於培養
• 利用細胞培養的囊是製作inactivated vaccines，
很昂貴
• 利用遺傳工程方法，將致病原當中的毒性成分，
如viral capsid protein, bacterial toxins, surface
antigens等基因可以選殖出來，然後生產subnit
vaccine
重組DNA技術用在生產疫苗，針對病毒與
細菌所造成的疾病
• 可將ß-galactosidase基因和目標基因融合，方
便大量生產與純化
• 酵母菌或昆蟲的細胞培養可作為宿主，特別是
需要蛋白質修飾的glycosylation時
• 另外加入T-cell epitopes基因，可增強疫苗的
immuno-stimulatory potential
• 已經應用在許多疾病的防制中
GMO評估
•
•
•
•
•
•
風險與利益
Risks vs Benefits
工商實利
人類與動植物疾病
生態影響
人心顧慮
GMO有夢！夢魘？
GMO有夢！夢魘？
GMO有夢！夢魘？
大陸兩院院士呼籲
澳洲Assessing risks from GMOs
• Gene Technology Act 2000
• In Australia, gene technology 受到管制 Gene
Technology Regulator
• 此法管制任何‘intentional release’ of a GMO 進入環境
需要許可（licence）
• Regulator 必須準備risk assessment 與risk
management plan, 並且得到環境部的意見
• 必須提交書面申請資料給Regulator
• 環境部評估GMO的風險，給部長建議
澳洲Assessing risks from GMOs
• 評估（Assessing）GMO 對環境是否安全
• 說明基因工程對動物、植物與微生物的改變
• 說明澳洲的環境獨特（unique environment），GMO的
影響可能不同於別國
• GMO對環境的影響會改變，隨著他的特性和與其他生
物互動的關係（interactions）與導入的基因和環境等
• 所以，風險評估需要個案為基礎（on a case-by-case
basis）
• GMO的創新，這些植物等在流出後會持續繁殖，自然
環境與生態系統運作的複雜性（complexity），插入基
因在演化上的命運等，在預測GMO的環境影響時，所
有這些因素都需要全盤考慮。
澳洲Assessing risks from GMOs
• GMO風險要考慮下列因素：
• 導入的基因是否和被修改的物種無關，或僅是在原有的
遺傳物質中多加入套數（copy），或做一些修改？
• 這新的或修改過的特性（trait）會否使得該導入的生物
（宿主host）變為有毒或能致病？
• 這新的或修改過的特性會否增進宿主的環境適應性
（fitness）？
• 這宿主在澳洲是否是外來（exotic）種，或本土（native）
種，有沒有病害（pest），野草（weed）或其他本土近
親（relatives）？
澳洲Assessing risks from GMOs
• 透過自然繁殖的步驟，這新的基因會否轉移至
其他物種，或該物種其他非基改個體，接近的
物種，或者透過其他稀有、不太可能的步驟或
意外，.傳給其他相關性遠（distantly related）
的物種
• 這些GMO被釋出多少，在哪裡？受到怎樣的管
理（managed）與控制（monitored）？
• 會否久存於預定區域以外的地方，和這些GMO
所生成的新物質（new substances）在環境中
的命運（fate）？
澳洲Assessing risks from GMOs
• Environment Protection and Biodiversity
Conservation Act 1999
• 保護澳洲的生物多樣性，如果GMO有這
些影響，同時會受到此法管制。
瑞典海洋與水管理機構
• Swedish Agency for Marine and Water Management
• 負責管理GMO和其所製作的物質的隔離使用
（contained use）、有意的釋放（deliberate release）
和上市
• 在隔離使用中，運作的許可（permit）是必須的，包括
研究和其他活動的管理
• 瑞典尚無水域生物的基因改造研究，魚類的基改主要在
美國、加拿大、日本、英國和大陸
瑞典海洋與水管理機構
• 從基改魚類的基因流出至野生的相近物種，風險比起陸
生動物高
• 對生態的影響而言，影響物種產卵（spawn）和獵食
（prey）的競爭
• 高生殖能力（reproductive capacity）的魚類和其後代
將分布於廣闊的區域
南韓對於GMO的管制
• Introduction
• 南韓簽署了Cartagena Protocol on Biosafety to
the Convention on Biological Diversity
(Cartagena Protocol) in 2000 ，在2008年起生
效
• 南韓2001 Act on Transboundary Movements
of Living Modified Organisms and Other
Related Matters (LMO Act)
南韓對於GMO的管制
• LMO Act目的在改進人類的生存環境，保護公
共衛生，和生物多樣性的保存與永續使用
（sustainable use），免受GMO影響
• 南韓GMO研究熱烈進行中，尚無合法
（authorized）的GMO耕作（cultivation
• 南韓有關GMO的安全上，尚無社會上與政治上
的共識（consensus）
南韓對於GMO的管制
• Structure of Pertinent Legislation
Ministry
Jurisdictional Area Under the LMO Act
Ministry of Science, Information,
Communication, Technology & Future
Planning (MSIP)
GMOs used in research and development
Ministry of Health & Welfare (MW)
GMO research facilities related to health,
medical sectors
Ministry of Environment (ME)
Environmental issues related to GMOs
Ministry of Agricultural, Food & Rural Affairs GMOs in agricultural, forestry, livestock
(MAFRA)
sectors, and in animal health improvement
Ministry of Oceans & Fisheries (MOF)
GMOs in oceans, inland bodies of water
Ministry of Food and Drug Safety (MFDS)
GMOs in food, medicine, medical devices
歐盟
• EU decision-making process
歐盟
• EU decision-making process
歐盟
• EU decision-making process
歐盟
• 田間試驗（field trial）
• 所有將GMO導入到環境的實驗都需要取
得核准（authorization）
• 國家的管理機構基於對環境和人類健康的
評估
• 授權GMO耕作（cultivation）
歐盟
• How to apply for authorization?
• 受管理，通告公共諮詢 public consultation.
• 國家要在90天內準備評估報告（assessment
report）給歐盟和會員國
• 可授權至10年，並可更新
• GMO上市後必受管制
• 公共諮詢是必須的
• 標示提供消費者選擇參考
• GMO的資訊必須在註冊時（register）登錄
歐盟
• 隔離使用（contained use）
• 指所有基改的微生物，包括病毒、動物、
植物等細胞培養，在容器（containment）
中進行，限制這些生物與環境接觸
• 這些活動包括基因修改、應用、貯存、運
輸、銷毀與散佈基改微生物
• 歐盟Directive 2009/41/EC 管理這些基改
微生物的隔離使用
歐盟
• 必須報告（notify）管理政府單位
• 政府單位確認設施合適進行這些活動，並不會
對人和環境造成危害
• 分成四級安全管理，第四級必須獲得政府單位
書面同意（written consent）
• Class 1 covers activities of no or negligible risk
• Class 2 covers activities of low risk
• Class 3 covers activities of moderate risk
• Class 4 covers activities of high risk
討論
• 中國大陸對於微生物GMO的管制？
• 台灣對於微生物GMO的管制？
延伸閱讀
• Metagenomics, biotechnology with non-culturable
microbes Ref 603
• Genetically Modified Vibrio harveyi Strains as Potential
Bioindicators of Mutagenic Pollution of Marine
Environments Ref 602
• Algal Transgenics and Biotechnology REF 601
– http://www.unibielefeld.de/biologie/Zellbiologie/publik/paper/2007tpj.pdf
• A Review of Genetic Engineering in Current
Aquaculture
• http://medcraveonline.com/JAMB/JAMB-02-00013.pdf
延伸閱讀
• Genetically Modified Organisms and Aquaculture 聯合
國農糧組織有關基因改造水產的完整文獻 Ref 604
• Cartagena Protocol on Biosafety to the Convention on
Biological Diversity聯合國文獻 Ref 605
• 基因改造微生物食品之安全性評估方法 Ref 606